顯微熒光光譜成像系統的組成

顯微熒光光譜成像系統（MFSIS）包括以下幾個(gè)部分：光源，分光系統，熒光顯微鏡，圖像適配器，高性能制冷CCD攝像器件，圖像采集卡，圖像生成與處理、圖像顯示等，系統結構如圖1所示。

圖1   顯微熒光光譜成像系統結構

工作過(guò)程：高功率單色激發(fā)光源激發(fā)顯微鏡下樣品，使之發(fā)射出特定的生物熒光.依據Stocks定律，熒光波長(cháng)大于激發(fā)光波長(cháng)，采用光譜分光元件可以從光譜上將二者分開(kāi)。在系統中可以通過(guò)對線(xiàn)性可變單色濾光片LVF的精確位移控制實(shí)現光譜分辨。通過(guò)LabVIEW軟件控制系統硬件改變其位置，并觸發(fā)圖像采集系統同步工作，即可獲取序列圖像—光譜圖像立方體。采集圖像信號并進(jìn)行處理后，就能夠獲取微區熒光光譜掃描譜圖的詳細信息。使用在NI視覺(jué)開(kāi)發(fā)模塊的基礎上所開(kāi)發(fā)的顯微熒光光譜分析軟件能夠對采集來(lái)的圖像進(jìn)行相關(guān)圖像處理與光譜信息分析。

顯微熒光光譜成像系統主要有三大功能模塊構成：基于LVF的分光系統控制模塊、序列圖像采集模塊和光譜圖像處理與分析模塊。

分光系統控制模塊

    光譜儀器的核心部分是色散系統，這是因為光譜儀器的四個(gè)最主要的基本特征即工作光譜范圍、色散率、分辨率和集光本領(lǐng)都決定于色散系統。本系統采用美國OCEAN公司的線(xiàn)性可變?yōu)V光片(LVF)作為色散元件，實(shí)現光譜阻斷或者通過(guò)。

分光系統的軟件部分主要是利用LabVIEW的串口工具來(lái)控制LVF的運動(dòng)。主要功能包括：

※ 系統復位

※ 往復運動(dòng)與指定波長(cháng)位置

※ 步進(jìn)工作：按照給定的間隔步長(cháng)，由按鍵控制電機步進(jìn)

※ 行程控制與精確定位

軟件系統中的控制窗口如圖2所示。運行時(shí)的操作過(guò)程為：給定set value的值，電機可以直接運行到指定的波長(cháng)值，并且在current wavelength處實(shí)時(shí)顯示當前波長(cháng)，然后根據給定的step值，點(diǎn)擊step按鈕，進(jìn)行電機的步進(jìn)。根據需要，可以隨時(shí)進(jìn)行中斷并復位。運行過(guò)程中，通過(guò)busy指示燈控件反映運行的信息，當程序運行正常時(shí)，指示燈閃爍，提示等待信息；當程序發(fā)現錯誤時(shí)，指示燈停止閃爍，提示欄會(huì )提示錯誤原因。以便及時(shí)更正錯誤信息。

圖2  分光系統的控制

序列圖像采集模塊

顯微序列圖像的采集采用了美國Pixera公司的150CL型高性能冷CCD，配備圖像采集卡，但是該卡無(wú)LabVIEW驅動(dòng)程序。本文中利用LabVIEW的DLL動(dòng)態(tài)函數調用功能，通過(guò)對Pixera公司提供控制SDK包的調用，實(shí)現了圖像采集的曝光時(shí)間設置、自動(dòng)增益調節、自動(dòng)對焦、積分時(shí)間調整、黑/白平衡、彩色/灰度切換以及CCD靈敏度設置等多項功能。本文設計了圖像采集的必備子VI，其中包括CCD驅動(dòng)、圖像靈敏度、制冷控制、熒光快速模式等，并將CCD采集到的圖像數據自動(dòng)存入一臨時(shí)文件，采用ReadFile子VI，讀取該JPEG格式的圖像文件，顯示在位于面板右側的圖片顯示區中。

除采用軟件控制外，通過(guò)一個(gè)手動(dòng)按鈕控件?？刂撇杉ǖ膱D像CCD采集工作，自動(dòng)完成圖像數據采集、存儲和顯示。此系統工作簡(jiǎn)便，快速，實(shí)時(shí)性強，能夠很好地配合整個(gè)系統工作。

光譜圖像模塊

    顯微熒光光譜曲線(xiàn)的繪制是本系統的特點(diǎn)之一。如圖3所示，經(jīng)過(guò)光譜掃描得到的序列圖像形成光譜立方體，其中從第0幅圖到第i幅圖分別對應不同的波長(cháng)值，居于圖像中心的像素波長(cháng)值分別為：λ00，λ00，……，λ0i。對于每幅圖象任意像素點(diǎn)，通過(guò)光譜計算可以確定其對應的波長(cháng)值和光強度值，由此實(shí)現繪制圖像上任意點(diǎn)的光譜曲線(xiàn)。

圖 3  序列圖像的光譜構成

以下以FluorCell#2熒光分子探針顯微熒光光譜成像為例。首先在鏡下調整成像的照明、CCD靈敏度、手動(dòng)調焦，選擇需要細節觀(guān)察的細胞區域。然后設定光譜立方體所需要的熒光采集參數、波長(cháng)步進(jìn)值、圖像內存區、光譜分光速度等，啟動(dòng)序列圖像采集，系統將自動(dòng)按照設定波長(cháng)獲取相應的光譜圖像序列，并將之存儲在指定目錄下，該目錄自動(dòng)設定為當前年月日時(shí)分，采集完成后可按照要求更改。系統工作界面如圖4：

圖４　Fluorcell#2的光譜圖像采集

完成圖像立方體采集后，選擇任意波長(cháng)圖像上感興趣的一個(gè)區域，然后通過(guò)計算，以該區域上每個(gè)像素點(diǎn)的強度中值或平均值為縱坐標，波長(cháng)值為橫坐標，便繪制出了光譜曲線(xiàn)，也稱(chēng)為“面域光譜”，如上圖中右下角曲線(xiàn)中的白點(diǎn)。所選定的區域還會(huì )被標記在系統的顯示面板上。

此外，考慮到圖像立方體中圖像的個(gè)數有限，容易造成曲線(xiàn)的不平滑。所以，我們對光譜曲線(xiàn)進(jìn)行擬合，采用三次樣條內插的方法，使整個(gè)曲線(xiàn)看起來(lái)更加平滑。如圖中右下方的曲線(xiàn)中紅線(xiàn)。

除光譜曲線(xiàn)繪制的功能外，軟件還增加了一些基本的圖像處理功能，用來(lái)針對圖像立方體中某一幅圖像進(jìn)行處理。主要有以下功能：彩色圖像顯示，RGB直方圖，RGB閾值分割，灰度圖顯示，三維圖，反相圖，圖像增強（圖像均衡化，低通濾波，高斯濾波，平滑濾波），邊緣銳化（拉普拉斯），灰度直方圖，灰度閾值濾波，面積計算與統計，直線(xiàn)強度分布圖。此外，為了方便對圖像立方體中圖像的整體了解，本系統設置了圖像的Flash顯示。即，按照一定的時(shí)間間隔，順序顯示多光譜圖像。從效果來(lái)看，類(lèi)似動(dòng)畫(huà)播放，使觀(guān)察者對圖像上目標的動(dòng)態(tài)信息變化有更好地了解。這種方法同樣可以應用于細胞形態(tài)變化的觀(guān)察。

應用實(shí)驗

1．梔子提取物抗病毒性研究

中藥梔子性味苦寒、歸心肺三焦經(jīng)，能瀉火除煩、清熱利尿、涼血解毒，具通瀉三焦火邪的功效，是中醫藥用于治療溫毒疫病的要藥。病毒感染特性：病毒的感染有賴(lài)于病毒吸附蛋白(virus attachment protein，VAP )對細胞表面受體的吸附。病毒吸附蛋白是啟動(dòng)病毒與宿主細胞之間相互作用、建立感染損傷細胞的必然途徑。

病毒與細胞受體的結合可以用熒光標記，將培養的人喉癌上皮傳代細胞Hep-2和病毒作用分為三組：

（1）實(shí)驗對照組y1，只加病毒，不加藥

（2）先吸附，后加藥組y2

（3）先加藥，后吸附組y3

每組按照時(shí)間間隔2秒采集圖像，得到各組的時(shí)間序列圖像組，并利用熒光光譜分析系統對圖像組進(jìn)行分析：

1. 首先以?xún)擅霝闀r(shí)間間隔，分別對三組細胞圖像進(jìn)行采集，各采10幅圖。
2. 然后對采集來(lái)的圖像進(jìn)行均衡化，平滑濾波以及高斯濾波。
3. 在濾波后的圖像上選擇目標區域，并將所選區域以及該區域對應的原始圖像區域進(jìn)行顯示與保存。
4. 對圖像進(jìn)行閾值濾波，以減去細胞外的背景信息。
5. 求得閾值濾波后細胞的像素面積。
6. 分別比較三種情況下細胞面積的變化。
   
             

圖５　Hep-2細胞抗病毒顯微光譜分析

如圖5所示，可以發(fā)現細胞在只加入病毒，和同時(shí)加入病毒和藥物兩種情況下變化趨勢是不同的。前者，細胞在形態(tài)上沒(méi)有明顯的變化，而后者細胞在形態(tài)上都存在較大變化，呈變大的趨勢。因此，可以認定加入梔子提取物對病毒的抑制作用很明顯。

2．茶葉熒光性綠斑病的研究

在日照、臨沂和泰安等地、市的茶園中，普遍發(fā)生一種茶樹(shù)成葉病害，其主要癥狀表現為：葉片下表皮局部異常凸起，呈綠色，而且病斑處在光照下能發(fā)綠色熒光，如圖6所示。

圖6  茶葉的綠斑病

通過(guò)對病害癥狀演化的系統觀(guān)測發(fā)現：此病害具有發(fā)綠色熒光的特性，且隨病害程度的加重，熒光增強，容易與其它一般病害的癥狀區分開(kāi)來(lái)。所以，掌握和利用這一特性可以幫助我們正確辨認此種病害。我們選定其中一病變區域的熒光測定光譜如圖7。

圖7   病變區熒光光譜

總結

顯微熒光光譜成像技術(shù)是顯微光譜成像技術(shù)中一種常用的方法，對于能夠產(chǎn)生自體熒光和激發(fā)熒光的物質(zhì)來(lái)說(shuō)，顯微熒光光譜成像技術(shù)具有顯著(zhù)的優(yōu)勢，包括無(wú)創(chuàng )性，可視性，精確性等特點(diǎn)。

本文基于LabVIEW軟件構建的顯微熒光光譜分析系統，實(shí)現了數字圖像采集、圖像處理及生物醫學(xué)中光譜圖像分析等功能。系統功能結構復雜，所有工作在一年時(shí)間內完成，相比MSDN來(lái)說(shuō)，大大節約了開(kāi)發(fā)時(shí)間，且界面清潔美觀(guān)、操作方便。